1. pcr反應體系優化是什麼意思

PCR反應五要素
參加PCR反應的物質主要有五種，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
1、引物 引物是PCR特異性反應的關鍵。每條引物10～100pmol，濃度過高會引起錯配和非特異性擴增，且可導致引物二聚體的形成。理論上，任何一段模板DNA序列，都能設計互補的寡核苷酸鏈做引物進行PCR擴增。設計引物應遵循以下原則：
①引物長度：15～30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度：以200～500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物鹼基：G+C含量以40～60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3』端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3』端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物的特異性：應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。

2. pcr優化體系中說的引物濃度是單引物濃度還是總引物濃度

引物是單引物的濃度，dNTP是四個混在一起的濃度。

3. PCR實驗結果出現多條條帶,如何進行優化

出現多條條帶表示PCR反應的特異性不高，可以進行如下優化嘗試：
1.適當提高PCR的退火溫度。退火溫度越高，DNA分子之間的配對越困難。這樣可以減少引物與模板之間非特異性的結合。
2.檢查一下引物的Tm值和序列結構，如果引物Tm值過高，上下游引物Tm值相差太大，或者引物單鏈易形成高級結構，都不利於PCR反應。必要時重新設計引物。
3.檢查一下模板純否。模板越純，條帶越特異。反之模板雜亂（例如cDNA文庫）就容易引起非特異性條帶。
4.如果模板和引物無法改良，可以選用更好的聚合酶產品。高保真和高活性的酶更容易得到特異性條帶。
你回答實驗報告應該是夠了。

4. 幾種PCR區別及引物問題求教

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Hot start PCR：
熱啟動 PCR，是提高 PCR 特異性和可信度的最好的方法之一。通過阻止溫度升高到變性溫度前的 PCR 反應的發生而阻止引物與基因組 DNA 上潛在的高同源性區域結合引起的錯誤引發（mispriming）。同時熱啟動還使引物通過互補區域鹼基配對而擴增產生的引物二聚體量大大降低。 熱啟動 PCR 可通過三種方式實現：
1) 手動熱啟動：配置反應液時忽略一種關鍵成分（聚合酶、Mg 離子或 dNTP），當反應液升溫到 80℃以上或變性溫度時再加入。手動熱啟動操作繁瑣，而且因為增加了一次開蓋操作，增加了污染的機會，同時由於管與管間的加樣誤差，可能使平行樣品間擴增結果產生差異；更簡單的手動熱啟動是在冰上配置反應液，待熱蓋升溫到變性溫度，按下擴增儀的暫停鍵，立即將反應管放在儀器上開始反應，當然這種方法的可信度也最低
2) 將聚合酶用石蠟珠包裹（或在反應液上部滴一滴融化的石蠟，待其凝固後，將聚合酶加到石蠟層的上部）使其與反應液的其它成分分開，直到反應液升溫融化石蠟後，酶才進入反應液中；
3) 使用熱啟動 DNA 聚合酶，這種酶通過化學修飾或與抗體結合，常溫下沒有活性，而只有當反應液加熱到變性溫度一段時間後，酶的活性才被釋放。使用熱啟動 DNA 聚合酶相比手動熱啟動操作簡便，缺點是用熱啟動 DNA 聚合酶的價格較高。
Touchdown PCR：
降落 PCR，是另一種簡單的降低非特異性擴增的方法，可規避對 PCR 循環條件進行耗時的優化實驗。降落 PCR 過程中，首輪循環的退火溫度設置在比引物的解鏈溫度高出幾度，使每個後續循環的退火溫度逐漸降到，直到退火溫度降到等於引物的解鏈溫度或比引物的解鏈溫度低幾度，後續的循環在此較低的退火溫度下完成，整個程序的退火溫度可降低 10-15℃。
在最初幾個循環內，高溫使引物的非特異性結合難以發生，只有同引物互補程度最大的模板序列（很可能這一序列就是我們感興趣的序列）才能發生退火事件，因此保證靶序列得到優先擴增。後續循環降低退火溫度可保證擴增效率，盡管最終的退火溫度降低到足以使非特異性產物有效擴增的溫度，由於靶分子已經開始指數期擴增，因此抑制非特異性產物的進一步形成。
Nested PCR：
巢式 PCR，通過使用兩套引物來進行兩次連續的反應，用來增加 DNA 擴增的特異性。在第一次反應中產生的產物可能包含非特異性擴增產物，然後使用兩個新的、結合位點位於原引物內部的引物進行第二次反應。第二套引物的使用可提高反應的特異性，增大單一產物產生的可能性。巢式 PCR 在提高特異性的同時，也增加了檢測的靈敏度。
Multiplex-PCR：
多重 PCR，指在一個 PCR 管中使用多對引物同時擴增超過一個的靶基因。同時分析單拷貝基因組的多個基因可避免分別擴增這些靶基造成對試劑和模板的浪費。使用多重 PCR 檢測引起遺傳疾病的基因突變時，可以同時擴增 6 個以上的靶點，也可同時檢測食品中多種病原菌的存在。在多重 PCR 基礎上發展的 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA，多重連接探針擴增技術) 使用單對引物即可完成對多個靶基因的擴增，避免了多重 PCR 耗時的優化步驟。
Long PCR（Long distance PCR，Long range PCR）：
長距離 PCR，普通的 Taq 聚合酶一般只能擴增不超過 3-5kb 的片段，通過使用特定的聚合酶和緩沖液成分，來擴增較長的 DNA 鏈（10-40kb 以上）。長距離 PCR 時經常會在 10-15 個循環後，使每個循環的延伸時間都比上一循環的時間增加 10 秒左右，以補償聚合酶活性的損失。
Clony PCR：
菌落 PCR，通過 PCR 手段來迅速篩選陽性克隆子。使用滅菌的牙簽將菌落直接挑到反應混合液中，通過 PCR 預變性步驟的高溫使細菌的基因組釋放作為 PCR 反應的模板。菌落 PCR 中使用的引物定位在插入位點外側的載體區，因此盡管插入的序列各不相同，也不影響擴增反應的進行。
RT-PCR（Reverse Transcription PCR）：
逆轉錄 PCR，是用來擴增、分離和鑒定細胞或組織的信使 RNA（mRNA）的技術。反應由兩個階段組成：
1. 使用逆轉錄酶，通過逆轉錄反應「RT」合成與 RNA 互補的 cDNA（complementary DNA）
2. 使用 PCR 擴增特異性的 cDNA。
由於 PCR 的預變性步驟可以用來失活逆轉錄酶，所以兩個階段可在同一管內完成。一些 DNA 聚合酶如 Tth 也有 RT 活性，因此可以單獨使用這種酶來完成兩步反應。
RT-PCR 可廣泛用於表達圖譜分析（用來確定基因的表達）；鑒定 RNA 轉錄子的序列，當相關的基因序列已知時，還可進一步知道基因組上外顯子和內含子的位置；檢測病毒例如 HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。
RACE-PCR（rapid amplification of cDNA ends）：
一種 RT-PCR 方法，當對 DNA 序列信息了解較少時，使用單個特異性引物加一個接頭引物來擴增 cDNA 的 5'端（對應轉錄的起始位點）或 3' 端從而產生新的 cDNA，重疊的 RACE 產物可結合起來產生全長的 cDNA 片段。
DD-PCR (differential display)：
差異顯示技術，用來鑒定不同組織中差異表達的基因。將不同組織的 RT-PCR 產物用短的、非特異性引物進行擴增，然後在凝膠上比對來源於不同組織的條帶，只在某種組織中才出現的條帶被認為是差異表達的。
Asymmetric PCR：
不對稱 PCR，可選擇性的擴增出靶 DNA 的一條鏈，從而用於測序反應或制備單鏈雜交探針。反應中限制一個引物的加入量，隨著這一引物的用盡，後續的擴增中另一引物延伸的產物量大大過量。這一技術的關鍵是使用的限制引物的量要合適，引物量過多，則產物主要是雙鏈 DNA；引物量過少，在前幾輪循環就被耗盡，結果導致單鏈的產量減少。在不對稱 PCR 的基礎上發展出 Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR，線性指數 PCR)，使數量限制的引物比過量的引物的解鏈溫度更高，從而維持較高的反應效率。
Assembly PCR(也稱作 Polymerase Cycling Assembly 或 PCA)：
通過使用多個具有短重疊區的長的寡核苷酸來合成長的 DNA 鏈的方法。通過寡核苷酸產生一條條正向或反向 DNA 鏈，而寡核苷酸的重疊區則確定鏈組裝的順序，因此可有選擇性的產生最終的長鏈 DNA 分子。
Methylation-specific PCR (MSP)：
甲基化特異性的 PCR，用於研究基因組 CpG 島的甲基化模式。首先是用亞硫酸氫鈉處理靶 DNA，使未甲基化的胞嘧啶鹼基轉化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物識別成胸腺嘧啶，然後分別用能區分修飾和非修飾模板的不同的引物來擴增（一對可識別胞嘧啶引物擴增原來甲基化的模板，令一對可識別尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物擴增非甲基化的模板）。結合定量 PCR，可以對甲基化程度進行定量。
Ligation-mediated PCR：
連接介導 PCR，首先使用小的寡核苷酸接頭連接靶 DNA 片段，然後選擇與接頭結合的 PCR 引物來擴增未知的靶片段。這一技術主要用在 DNA 測序、染色體步移技術（genome walking）和 DNA 指紋圖譜等。
AFLP（Amplified fragment length polymorphism）：
擴增片段長度多態性，通過擴增使不同生物基因組呈現不同長度的片段。
AP-PCR (arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA)：
機擴增多態性 DNA，使用隨機寡核苷酸片段來擴增序列未知的靶基因，形成基因組指紋圖譜，用來分析物種的相關性。
Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR：
可變數目串聯重復序列 PCR，使引物定位在具有長度多態性的靶基因區，通過在凝膠電泳後對產物的大小進行分析來研究基因分型。
Allele-specific PCR：
等位基因特異性 PCR，設計引物時選擇在基因組的多態性區域，使等位基因的突變定位在（或接近）引物的 3' 端，在嚴謹的反應條件下，存在錯配鹼基的引物不能起始復制，而只有完全匹配的引物才能起始復制，產生的產物因此顯示不同的基因型。
InterSequence-Specific PCR(ISSR-PCR)：
一種 DNA 指紋圖譜技術，所選的引物定位在基因組的片段重復區（如 Alu 族），擴增後產生基於不同產物長度的唯一的指紋圖譜。
Inverse PCR：
反向 PCR，允許擴增已知序列側翼的 DNA 區。首先將靶 DNA 用限制性內切酶進行多輪消化，然後連接被消化的片段構建環狀的分子，引物設計成可從序列已知的區域向外側延伸，結果擴增出環狀分子上剩餘的序列。
Quantitative PCR(Q-PCR)：
定量 PCR，用來測定樣本中的靶 DNA 的量。最初的定量 PCR 主要是指 Competitive PCR（競爭定量 PCR）。競爭定量 PCR：在反應混合物中加入起始拷貝數已知的內部對照，對照具有同靶序列相同的引物結合位點，但產生的產物長度與靶序列產生的產物長度不同，在 PCR 過程中對照與靶基因競爭相同的引物。反應後通過比對對照和靶基因產生的產物量推斷初始靶基因的拷貝數，由於內部對照和靶基因在擴增中的效率不一定相同，所以定量結果會產生偏差。
Real-Time PCR：
實時 PCR，由於通常的 PCR 在幾十個循環後都會進入平台期，產物的量與初始模板量不在成正比，因此只能用來定性。而實時 PCR 通過使用熒光染料，例如 SYBR Green 或熒游標記探針，例如 TaqMan 可用來檢測隨著擴增的進行，產物量的變化而進行定量。

5. primer 5.0設計引物出現dimer怎麼辦

在多種條件限制下，完全沒有二聚體有時是很難做到的，只要引物3'端沒較長的互補鹼基就行。在進行PCR的時候通過優化條件一樣可以取得滿意的結果。

6. 引物設計如何避免引起移碼突變的產生

5‘－端引物的設計是關鍵。ATG上游的序列不涉及閱讀框，所以在5’端HindIII位點到ATG的序列不會帶來移碼突變。但是在大腸桿菌中核糖體受一段富含嘌呤的SD序列引導從而識別AUG起始密碼，核糖體結合位點RBS和起始密碼AUG之間的距離以及鹼基的組成對翻譯的效率有顯著影響，在設計的時候要注意。 一般建議在ATG上游加入保守序列5'-UAAGGAGGUGA-3'（其中AGGAGG是RBS保守序列），並根據預實驗結果調節，如果載體本身已經帶了RBS序列就可以不加。同時在ATG與RBS之間要有一定的空間序列（約小於10個鹼基）， 可以採用靶基因ATG上游的序列。這些涉及方法是經驗之談，對每一個基因都需要實驗優化。祝您好運！

7. 引物設計的、軟體有哪些有什麼優點和缺點

引物設計相關軟體！
NoePrimer 2.03 獨特的引物設計軟體
Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析與引物設計，非常棒的一個軟體。
Oligo 7.36 Demo 引物設計分析著名軟體，主要應用於核酸序列引物分析設計軟體。
Primer D'Signer 1.1 免費的引物設計輔助軟體，專門用於pASK-IBA和pPR-IBA表達載體，簡化引物設計工作。
Array Designer 4.25 Demo DNA微陣列（microarray）軟體，批量設計DNA和寡核苷酸引物工具。
Beacon Designer 7.80 Demo 實時熒光定量PCR分子信標(Molecular beacon )及TaqMan探針設計軟體。
NetPrimer java語言寫成的免費引物設計軟體，用IE打開運行。
TGGE-STAR DOS軟體，PCR結合梯度凝膠電泳實驗引物設計軟體。
e-PCR 2.3.9 電子克隆是一種電腦軟體，用來識別DNA序列標簽位點（STSs)。
FastPCR 6.0.165b2 快速設計各種類型PCR引物，還包括一些常用的DNA與蛋白序列軟體工具；
OligoMaster 1.0.164 多用戶寡核苷酸管理軟體，可建立寡核苷酸資料庫
PerlPrimer v1.1.19 一個免費的用來設計引物的開源軟體。
AmplifX 1.5.4 設計與管理引物的軟體。
AutoDimer 1.0 快速篩選二聚體引物軟體。
MutaPrimer 1.00 用於定點突變的引物設計桌面工具軟體
ORFprimer 1.6.4.1 JAVA語言設計的引物設計軟體
Primer Prim'er 5.6.0 Flash製作的PCR引物設計軟體。
PCR Analyzer 1.0 實時RT-PCR反應中估算初始擴增子濃度軟體
在線工具
DNAWorks 3.0 是一個幫助進行基因合成的設計寡核苷酸序列的免費程序。 程序僅需要輸入一些簡單的信息，比如，目標蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的溫度。程序輸出的為適合所選擇生物表達的優化密碼子的核酸序列。利用DNAWorks的幫助，用兩步PCR法，可以成功合成長度達到3000鹼基對的基因。原始網站。
The Primer Generator 在線引物設計程序。
Primer 3 比較有名的在線引物設計程序。
Primo Pro 3.4 在線PCR引物設計java系列軟體。
Web Primer 斯坦福大學提供的在線引物設計軟體。
AutoPrime 快速設計真核表達實時定量PCR引物在線軟體 .

一般性引物自動搜索可採用「Premier Primer 5」軟體，而引物的評價分析則可採用「Oligo 6」軟體。

附上兩款軟體使用方法！
Primer Premier 5.0 的使用技巧簡介
1. 功能
「Premier」的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設計( )、限制性內切酶位點分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。「Premier」還具有同源性分析功能（ ），但並非其特長，在此略過。此外，該軟體還有一些特殊功能，其中最重要的是設計簡並引物，另外還有序列「朗讀」、DNA 與蛋白序列的互換（ ）、語音提示鍵盤輸入（ ）等等。
有時需要根據一段氨基酸序列反推到DNA 來設計引物，由於大多數氨基酸（20 種常見結構氨基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列時，會遇到部分鹼基的不確定性。這樣設計並合成的引物實際上是多個序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點有所變化，稱之為簡並引物。遺傳密碼規則因物種或細胞亞結構的不同而異，比如在線粒體內的遺傳密碼與細胞核是不一樣的。「Premier」可以針對模板DNA 的來源以相應的遺傳密碼規則轉換DNA 和氨基酸序列。軟體共給出八種生物亞結構的不同遺傳密碼規則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear）、無脊椎動物線粒體（Invertebrate Mitochondrion）、支原體（Mycoplasma）、植物線粒體（Plant Mitochondrion）、原生動物線粒體（Protozoan Mitochondrion）、一般標准（Standard）、脊椎動物線粒體（Vertebrate Mitochondrion）和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步驟及技巧
「Premier」軟體啟動界面如下：
(轉載的時候就沒有圖)
其主要功能在主界面上一目瞭然（按鈕功能如上述）。限制性酶切點分析及基元查找功能比較簡單，點擊該功能按鈕後，選擇相應的限制性內切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按確定即可。常見的限制性內切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新限制性內切酶或基元。
進行引物設計時，點擊按鈕，界面如下：
進一步點擊按鈕，出現「search criteria」窗口，有多種參數可以調整。搜索目的（Seach For）有三種選項，PCR 引物（PCR Primers），測序引物（Sequencing Primers），雜交****（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區域（Search Ranges），引物長度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數選擇（Search Parameters）等等。使用者可根據自己的需要設定各項參數。如果沒有特殊要求，建議使用默認設置。然
後按，隨之出現的Search Progress 窗口中顯示Search Completed 時，再按，這時搜索結果以表格的形式出現，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認顯示為成對方式，並按優劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標基本都能達標（如下圖）。
點擊其中一對引物，如第1#引物，並把上述窗口挪開或退出，顯示「Peimer Premier」主窗口，如圖所示：
該圖分三部分，最上面是圖示PCR 模板及產物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質，最下面是四種重要指標的分析，包括發夾結構（Hairpin），二聚體（Dimer），錯誤引發情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當所分析的引物有這四種結構的形成可能時，按鈕由變成，點擊該按鈕，在左下角的窗口中就會出現該結構的形成情況。一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應用。
在需要對引物進行修飾編輯時，如在5』端加入酶切位點，可點擊，然後修改引物序列。若要回到搜索結果中，則點擊按鈕。如果要設計簡並引物，只需根據源氨基酸序列的物種來源選擇前述的八種遺傳密碼規則，反推至DNA 序列即可。對簡並引物的分析不需像一般引物那樣嚴格。總之，「Premier」有優秀的引物自動搜索功能，同時可進行部分指標的分析，而且容易 使用，是一個相當不錯的軟體。

Oligo 6.22 使用技巧簡介
1. 功能
在專門的引物設計軟體中，「Oligo」是最著名的。它的使用並不十分復雜，但初學者容易被其復雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0 的初始界面是兩個圖：Tm 圖和ΔG 圖；Oligo 6.22 的界面更復雜，出現三個圖，加了個Frq 圖。「Oligo」的功能比「Premier」還要單一，就是引物設計。但它的引物分析功能如此強大以至於能風靡全世界。
2. 使用（以Oligo 6.22 為例）
Oligo 6.22 的啟動界面如下：
圖中顯示的三個指標分別為Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，為鄰近6至7 個鹼基組成的亞單位在一個指定資料庫文件中的出現頻率。該頻率高則可增加錯誤引發的可能性。因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade 排列方式不太方便，可從windows菜單改為tili 方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標，如Frq，這樣界面的結構同於Oligo5.0，只是顯示更清楚了。
經過Windows/Tili 項後的顯示如圖：
在設計時，可依據圖上三種指標的信息選取序列，如果覺得合適，可點擊Tm 圖塊上左下角的Upper 按鈕，選好上游引物，此時該按鈕變成，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。∆G 值反映了序列與模板的結合強度，最好引物的∆G 值在5』端和中間值比較高，而在3』端相對低（如圖：）
Tm 值曲線以選取72℃附近為佳，5』到3』的下降形狀也有利於引物引發聚合反應。Frq 曲線為「Oligo 6」新引進的一個指標，揭示了序列片段存在的重復機率大小。選取引物時，宜選用3』端Frq 值相對較低的片段。
當上下游引物全選好以後，需要對引物進行評價並根據評價對引物進行修改。首先檢查引物二聚體尤其是3』端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測（非克隆）性PCR，對引物位置、產物大小要求較低，因而應盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項檢查是發夾結構（hairpin）；與二聚體相同，發夾結構的能值越低越好。一般來說，這兩項結構的能值以不超過4.5 為好。
當然，在設計克隆目的的PCR 引物時，引物兩端一般都添加酶切位點，必然存在發夾結構，而且能值不會太低。這種PCR 需要通過靈活調控退火溫度以達到最好效果，對引物的發夾結構的檢測就不應要求太高。第三項檢查為GC 含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，導致引物的GC 含量不能被控制在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利於退火溫度的選擇。如果PCR 的模板不是基因組DNA，而是一個特定模板序列，那麼最好還進行False priming site 的檢測。這項檢查
可以看出引物在非目的位點引發PCR 反應的可能性。如果引物在錯配位點的引發效率比較高，就可能出假陽性的PCR 結果。一般在錯配引發效率以不超過100 為好，但對於特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發效率為450 以上，而在錯誤位點的引發效率為130，那麼這對引物也是可以接受的。當我們結束以上四項檢測，按Alt+P 鍵彈出PCR 窗口，其中總結性地顯示該引物的位置、產物大小、Tm 值等參數，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評價。
由於「Oligo」軟體的引物自動搜索功能與「Primer Premier 5」的相類似，並且似乎並不比後者更好用，在此不再贅述。其實，使用軟體自動搜索引物就是讓計算機按照人的要求去尋找最佳引物，如果參數設置得當將大大提高工作效率。
除了本地引物設計軟體之外，現在還有一些網上引物設計軟體，如由Whitehead Institute開發的「Primer 3」等（本網站http://210.72.11.60/ 已引進並調試好該軟體，歡迎使用）。該軟體的獨特之處在於，對全基因組PCR 的引物設計；可以將設計好的引物對後台核酸資料庫進行比對，發現並排除可引發錯配的引物。因此建議經常做全基因組PCR 的用戶試用。

8. 如何優化PCR反應中退火溫度

首先要看你的條帶是否清晰，雖然亮度不夠但是清晰度應該高，沒有拖尾沒有非特異條帶和引物二聚體，如果以上都沒有，僅僅是目標條帶不夠亮的話，我覺得
你可以將25微升體積同比放大至50微升反應體系，相應的制膠的時候插孔槽用大梳子而不是小的那種。還有很重要的就是你的核酸染料是什麼？我用過幾種核酸染料感覺還是EB亮度最好，雖然毒性大了點。

如果條帶不夠亮，還有拖尾、非特異條帶、引物二聚體等問題，那就是你反應體系中需要優化。1、出現非特異擴增可能是你的引物設計上特異性差或者引物濃度過高，Mg濃度或酶含量過高（適當改變Mg濃度從1mM到3mM，間隔0.5mM進行梯度試驗，或者酶含量改變按0.5U為間隔梯度試驗。）2、如果出現拖尾，，要考慮引物特異性和模板純度，另外循環數、退火溫度以及Mg含量過高、dNTP過多等也可能造成拖尾。

9. PCR條件優化

在PCR的優化開始階段，應用新的DNA模板，引物或熱穩定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其擴增效果一般總不是最佳的。這種PCR反應通常要求盡量抑制非特異性擴增和（或）增加目的DNA產物的產率。表1列舉了一些通常遇到的問題和對PCR反應進行優化的一些推薦方法。
表1 PCR擴增的疑難解析
問題 解釋 補救措施
目的產物條帶在兩種陽性對照管與試驗管內部呈現明顯的非常模糊的帶型。目的產物條帶有時呈不清晰的成片條帶，條帶在凝膠中擴散到較期望分子量更小的DNA分子量的區域內。 無效引導或無效延伸 通過建立兩個引物不同濃度的PCR系列試驗，從中發現兩個引物的最適濃度；通過建立降落PCR系列試驗，摸索最佳鎂離子濃度的水平。
應用GC-Melt（Clonte-CH）PCR反應混合液。
應用盡可能低的復性溫度（即退火溫度）考慮添加佐劑，如在反應體系中加牛白蛋白（0.2~0.6mg/ml），二甲基亞碸（5%）或甘油（5%）
目的產物條帶在陽性對照管2與試驗管內呈現非常模糊的帶型，而在陽性對照管1內卻又很強的條帶。 模板DNA不純。 重新純化模板DNA，用酚：氯仿抽提兩次，乙醇沉澱回收。純化後的DNA樣品溶解於水中（不含EDTA）。
在陰性對照管擴增出目的條帶。 盛模板DNA的塑料器具溶解模板DNA的溶液污染所致。 重新配置新的試劑。
擴增產物呈現明顯的分子質量錯誤的條帶。 根據一條或兩條引物的非特異性引導。 縮短復性時間或增加復性溫度。
擴增目的產物DNA呈現模糊的廣泛的成片條帶。 要麼為引物二聚體所致的擴增；要麼為模板DNA過量。 檢查引物是否均一及模板DNA序列內是否具有高度重復序列存在。優化每條獨立引物的濃度。
應用降落PCR和（或）熱啟動PCR。降低模板DNA的量。

對可能發生在PCR過程中的主要問題的解析
表2描寫在PCR擴增反應中可能遇到的一些問題以及提供怎樣解決這些問題的一些方法。
表2 多種PCR擴增過程的一些疑難問題的診斷與解決方法
症狀 可能原因 補救措施
擴增的目的產物條帶較弱或不能檢測到相應的條帶。 試劑不合格；PCR儀有故障；擴增程序設置錯誤。 在兩台不同的PCR儀上用新鮮購買的試劑與老的試劑分別進行PCR，比較其擴增產物結果。
復性條件不是最合適的。 重新計算引物Tm；應用降落PCR，最好再結合熱啟動PCR。
驗證引物濃度，如果必要可優化引物的濃度；若引物顯然是問題的症結所在，重新設計合成新的引物。
被復性結合到模板上的引物不適合延伸。 優化MgCl2、模板DNA和dNTP的濃度；試驗此PCR的pH值的范圍；考慮用N-三甲基甘氨酸、N,N-二羥乙基甘氨酸或EPP等具有更低溫度變異系數的化學物質替代Tris（Cheng et al. 1994）。
應用新鮮制備的熱穩定DNA聚合酶。
重新純化模板DNA以去除抑制物。
在恆定復性溫度（55℃）條件下增加PCR循環數。
如果問題依然存在，添加增強劑（如10%二甲基亞碸，5% PEG6000或10%甘油）。
如果問題依然存在，用首次擴增的PCR產物進行1：100稀釋後作為模板，再加入新的PCR緩沖液與引物在恆定復性溫度條件下進行30個循環的第二次PCR擴增；或者進行嵌套式PCR擴增。
應用GC-Melt（CLONTECH）PCR反應混合液。
變性不完全。 增加變性的時間或者設置更高的變性溫度。
兩個引物之間的距離太大。 應用那些能夠擴增大DNA片段的熱穩定DNA聚合酶。
多種擴增產物條帶 應用降落PCR，最好再結合熱啟動PCR或加強PCR（booster PCR）。
優化MgCl2、模板DNA、熱穩定DNA聚合酶及dNTP的濃度。
用首次擴增的PCR產物進行1：100稀釋後作為模板，再加入新的PCR緩沖液與引物在恆定復性溫度條件下進行30個循環的第二次PCR擴增；或者進行嵌套式PCR擴增；或者從凝膠上切割目的條帶作模板重新進行PCR擴增。
確證引物的濃度，如果必要，可優化引物的濃度；若問題仍然存在，重新設計合成引物。
引物二聚體過量 應用降落PCR，最好再結合熱啟動或加強PCR（booster PCR）；若問題仍然存在，重新設計合成引物，要特別注意引物3』末端的序列。

查點資料不容易，給個最佳吧謝謝