1. pcr反应体系优化是什么意思

PCR反应五要素
参加PCR反应的物质主要有五种，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
1、引物 引物是PCR特异性反应的关键。每条引物10～100pmol，浓度过高会引起错配和非特异性扩增，且可导致引物二聚体的形成。理论上，任何一段模板DNA序列，都能设计互补的寡核苷酸链做引物进行PCR扩增。设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15～30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200～500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40～60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3’端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物的特异性：应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。

2. pcr优化体系中说的引物浓度是单引物浓度还是总引物浓度

引物是单引物的浓度，dNTP是四个混在一起的浓度。

3. PCR实验结果出现多条条带,如何进行优化

出现多条条带表示PCR反应的特异性不高，可以进行如下优化尝试：
1.适当提高PCR的退火温度。退火温度越高，DNA分子之间的配对越困难。这样可以减少引物与模板之间非特异性的结合。
2.检查一下引物的Tm值和序列结构，如果引物Tm值过高，上下游引物Tm值相差太大，或者引物单链易形成高级结构，都不利于PCR反应。必要时重新设计引物。
3.检查一下模板纯否。模板越纯，条带越特异。反之模板杂乱（例如cDNA文库）就容易引起非特异性条带。
4.如果模板和引物无法改良，可以选用更好的聚合酶产品。高保真和高活性的酶更容易得到特异性条带。
你回答实验报告应该是够了。

4. 几种PCR区别及引物问题求教

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Hot start PCR：
热启动 PCR，是提高 PCR 特异性和可信度的最好的方法之一。通过阻止温度升高到变性温度前的 PCR 反应的发生而阻止引物与基因组 DNA 上潜在的高同源性区域结合引起的错误引发（mispriming）。同时热启动还使引物通过互补区域碱基配对而扩增产生的引物二聚体量大大降低。 热启动 PCR 可通过三种方式实现：
1) 手动热启动：配置反应液时忽略一种关键成分（聚合酶、Mg 离子或 dNTP），当反应液升温到 80℃以上或变性温度时再加入。手动热启动操作繁琐，而且因为增加了一次开盖操作，增加了污染的机会，同时由于管与管间的加样误差，可能使平行样品间扩增结果产生差异；更简单的手动热启动是在冰上配置反应液，待热盖升温到变性温度，按下扩增仪的暂停键，立即将反应管放在仪器上开始反应，当然这种方法的可信度也最低
2) 将聚合酶用石蜡珠包裹（或在反应液上部滴一滴融化的石蜡，待其凝固后，将聚合酶加到石蜡层的上部）使其与反应液的其它成分分开，直到反应液升温融化石蜡后，酶才进入反应液中；
3) 使用热启动 DNA 聚合酶，这种酶通过化学修饰或与抗体结合，常温下没有活性，而只有当反应液加热到变性温度一段时间后，酶的活性才被释放。使用热启动 DNA 聚合酶相比手动热启动操作简便，缺点是用热启动 DNA 聚合酶的价格较高。
Touchdown PCR：
降落 PCR，是另一种简单的降低非特异性扩增的方法，可规避对 PCR 循环条件进行耗时的优化实验。降落 PCR 过程中，首轮循环的退火温度设置在比引物的解链温度高出几度，使每个后续循环的退火温度逐渐降到，直到退火温度降到等于引物的解链温度或比引物的解链温度低几度，后续的循环在此较低的退火温度下完成，整个程序的退火温度可降低 10-15℃。
在最初几个循环内，高温使引物的非特异性结合难以发生，只有同引物互补程度最大的模板序列（很可能这一序列就是我们感兴趣的序列）才能发生退火事件，因此保证靶序列得到优先扩增。后续循环降低退火温度可保证扩增效率，尽管最终的退火温度降低到足以使非特异性产物有效扩增的温度，由于靶分子已经开始指数期扩增，因此抑制非特异性产物的进一步形成。
Nested PCR：
巢式 PCR，通过使用两套引物来进行两次连续的反应，用来增加 DNA 扩增的特异性。在第一次反应中产生的产物可能包含非特异性扩增产物，然后使用两个新的、结合位点位于原引物内部的引物进行第二次反应。第二套引物的使用可提高反应的特异性，增大单一产物产生的可能性。巢式 PCR 在提高特异性的同时，也增加了检测的灵敏度。
Multiplex-PCR：
多重 PCR，指在一个 PCR 管中使用多对引物同时扩增超过一个的靶基因。同时分析单拷贝基因组的多个基因可避免分别扩增这些靶基造成对试剂和模板的浪费。使用多重 PCR 检测引起遗传疾病的基因突变时，可以同时扩增 6 个以上的靶点，也可同时检测食品中多种病原菌的存在。在多重 PCR 基础上发展的 Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA，多重连接探针扩增技术) 使用单对引物即可完成对多个靶基因的扩增，避免了多重 PCR 耗时的优化步骤。
Long PCR（Long distance PCR，Long range PCR）：
长距离 PCR，普通的 Taq 聚合酶一般只能扩增不超过 3-5kb 的片段，通过使用特定的聚合酶和缓冲液成分，来扩增较长的 DNA 链（10-40kb 以上）。长距离 PCR 时经常会在 10-15 个循环后，使每个循环的延伸时间都比上一循环的时间增加 10 秒左右，以补偿聚合酶活性的损失。
Clony PCR：
菌落 PCR，通过 PCR 手段来迅速筛选阳性克隆子。使用灭菌的牙签将菌落直接挑到反应混合液中，通过 PCR 预变性步骤的高温使细菌的基因组释放作为 PCR 反应的模板。菌落 PCR 中使用的引物定位在插入位点外侧的载体区，因此尽管插入的序列各不相同，也不影响扩增反应的进行。
RT-PCR（Reverse Transcription PCR）：
逆转录 PCR，是用来扩增、分离和鉴定细胞或组织的信使 RNA（mRNA）的技术。反应由两个阶段组成：
1. 使用逆转录酶，通过逆转录反应“RT”合成与 RNA 互补的 cDNA（complementary DNA）
2. 使用 PCR 扩增特异性的 cDNA。
由于 PCR 的预变性步骤可以用来失活逆转录酶，所以两个阶段可在同一管内完成。一些 DNA 聚合酶如 Tth 也有 RT 活性，因此可以单独使用这种酶来完成两步反应。
RT-PCR 可广泛用于表达图谱分析（用来确定基因的表达）；鉴定 RNA 转录子的序列，当相关的基因序列已知时，还可进一步知道基因组上外显子和内含子的位置；检测病毒例如 HIV、引起麻疹和腮腺炎的病毒。
RACE-PCR（rapid amplification of cDNA ends）：
一种 RT-PCR 方法，当对 DNA 序列信息了解较少时，使用单个特异性引物加一个接头引物来扩增 cDNA 的 5'端（对应转录的起始位点）或 3' 端从而产生新的 cDNA，重叠的 RACE 产物可结合起来产生全长的 cDNA 片段。
DD-PCR (differential display)：
差异显示技术，用来鉴定不同组织中差异表达的基因。将不同组织的 RT-PCR 产物用短的、非特异性引物进行扩增，然后在凝胶上比对来源于不同组织的条带，只在某种组织中才出现的条带被认为是差异表达的。
Asymmetric PCR：
不对称 PCR，可选择性的扩增出靶 DNA 的一条链，从而用于测序反应或制备单链杂交探针。反应中限制一个引物的加入量，随着这一引物的用尽，后续的扩增中另一引物延伸的产物量大大过量。这一技术的关键是使用的限制引物的量要合适，引物量过多，则产物主要是双链 DNA；引物量过少，在前几轮循环就被耗尽，结果导致单链的产量减少。在不对称 PCR 的基础上发展出 Linear-After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR，线性指数 PCR)，使数量限制的引物比过量的引物的解链温度更高，从而维持较高的反应效率。
Assembly PCR(也称作 Polymerase Cycling Assembly 或 PCA)：
通过使用多个具有短重叠区的长的寡核苷酸来合成长的 DNA 链的方法。通过寡核苷酸产生一条条正向或反向 DNA 链，而寡核苷酸的重叠区则确定链组装的顺序，因此可有选择性的产生最终的长链 DNA 分子。
Methylation-specific PCR (MSP)：
甲基化特异性的 PCR，用于研究基因组 CpG 岛的甲基化模式。首先是用亚硫酸氢钠处理靶 DNA，使未甲基化的胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶，尿嘧啶可被引物识别成胸腺嘧啶，然后分别用能区分修饰和非修饰模板的不同的引物来扩增（一对可识别胞嘧啶引物扩增原来甲基化的模板，令一对可识别尿嘧啶或胸腺嘧啶的引物扩增非甲基化的模板）。结合定量 PCR，可以对甲基化程度进行定量。
Ligation-mediated PCR：
连接介导 PCR，首先使用小的寡核苷酸接头连接靶 DNA 片段，然后选择与接头结合的 PCR 引物来扩增未知的靶片段。这一技术主要用在 DNA 测序、染色体步移技术（genome walking）和 DNA 指纹图谱等。
AFLP（Amplified fragment length polymorphism）：
扩增片段长度多态性，通过扩增使不同生物基因组呈现不同长度的片段。
AP-PCR (arbitrary primed)/RAPD (random amplified polymorphic DNA)：
机扩增多态性 DNA，使用随机寡核苷酸片段来扩增序列未知的靶基因，形成基因组指纹图谱，用来分析物种的相关性。
Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) PCR：
可变数目串联重复序列 PCR，使引物定位在具有长度多态性的靶基因区，通过在凝胶电泳后对产物的大小进行分析来研究基因分型。
Allele-specific PCR：
等位基因特异性 PCR，设计引物时选择在基因组的多态性区域，使等位基因的突变定位在（或接近）引物的 3' 端，在严谨的反应条件下，存在错配碱基的引物不能起始复制，而只有完全匹配的引物才能起始复制，产生的产物因此显示不同的基因型。
InterSequence-Specific PCR(ISSR-PCR)：
一种 DNA 指纹图谱技术，所选的引物定位在基因组的片段重复区（如 Alu 族），扩增后产生基于不同产物长度的唯一的指纹图谱。
Inverse PCR：
反向 PCR，允许扩增已知序列侧翼的 DNA 区。首先将靶 DNA 用限制性内切酶进行多轮消化，然后连接被消化的片段构建环状的分子，引物设计成可从序列已知的区域向外侧延伸，结果扩增出环状分子上剩余的序列。
Quantitative PCR(Q-PCR)：
定量 PCR，用来测定样本中的靶 DNA 的量。最初的定量 PCR 主要是指 Competitive PCR（竞争定量 PCR）。竞争定量 PCR：在反应混合物中加入起始拷贝数已知的内部对照，对照具有同靶序列相同的引物结合位点，但产生的产物长度与靶序列产生的产物长度不同，在 PCR 过程中对照与靶基因竞争相同的引物。反应后通过比对对照和靶基因产生的产物量推断初始靶基因的拷贝数，由于内部对照和靶基因在扩增中的效率不一定相同，所以定量结果会产生偏差。
Real-Time PCR：
实时 PCR，由于通常的 PCR 在几十个循环后都会进入平台期，产物的量与初始模板量不在成正比，因此只能用来定性。而实时 PCR 通过使用荧光染料，例如 SYBR Green 或荧光标记探针，例如 TaqMan 可用来检测随着扩增的进行，产物量的变化而进行定量。

5. primer 5.0设计引物出现dimer怎么办

在多种条件限制下，完全没有二聚体有时是很难做到的，只要引物3'端没较长的互补碱基就行。在进行PCR的时候通过优化条件一样可以取得满意的结果。

6. 引物设计如何避免引起移码突变的产生

5‘－端引物的设计是关键。ATG上游的序列不涉及阅读框，所以在5’端HindIII位点到ATG的序列不会带来移码突变。但是在大肠杆菌中核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码，核糖体结合位点RBS和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响，在设计的时候要注意。 一般建议在ATG上游加入保守序列5'-UAAGGAGGUGA-3'（其中AGGAGG是RBS保守序列），并根据预实验结果调节，如果载体本身已经带了RBS序列就可以不加。同时在ATG与RBS之间要有一定的空间序列（约小于10个碱基）， 可以采用靶基因ATG上游的序列。这些涉及方法是经验之谈，对每一个基因都需要实验优化。祝您好运！

7. 引物设计的、软件有哪些有什么优点和缺点

引物设计相关软件！
NoePrimer 2.03 独特的引物设计软件
Primer Premier 6.0 DEMO 序列分析与引物设计，非常棒的一个软件。
Oligo 7.36 Demo 引物设计分析著名软件，主要应用于核酸序列引物分析设计软件。
Primer D'Signer 1.1 免费的引物设计辅助软件，专门用于pASK-IBA和pPR-IBA表达载体，简化引物设计工作。
Array Designer 4.25 Demo DNA微阵列（microarray）软件，批量设计DNA和寡核苷酸引物工具。
Beacon Designer 7.80 Demo 实时荧光定量PCR分子信标(Molecular beacon )及TaqMan探针设计软件。
NetPrimer java语言写成的免费引物设计软件，用IE打开运行。
TGGE-STAR DOS软件，PCR结合梯度凝胶电泳实验引物设计软件。
e-PCR 2.3.9 电子克隆是一种电脑软件，用来识别DNA序列标签位点（STSs)。
FastPCR 6.0.165b2 快速设计各种类型PCR引物，还包括一些常用的DNA与蛋白序列软件工具；
OligoMaster 1.0.164 多用户寡核苷酸管理软件，可建立寡核苷酸数据库
PerlPrimer v1.1.19 一个免费的用来设计引物的开源软件。
AmplifX 1.5.4 设计与管理引物的软件。
AutoDimer 1.0 快速筛选二聚体引物软件。
MutaPrimer 1.00 用于定点突变的引物设计桌面工具软件
ORFprimer 1.6.4.1 JAVA语言设计的引物设计软件
Primer Prim'er 5.6.0 Flash制作的PCR引物设计软件。
PCR Analyzer 1.0 实时RT-PCR反应中估算初始扩增子浓度软件
在线工具
DNAWorks 3.0 是一个帮助进行基因合成的设计寡核苷酸序列的免费程序。 程序仅需要输入一些简单的信息，比如，目标蛋白的氨基酸序列及合成核酸序列的温度。程序输出的为适合所选择生物表达的优化密码子的核酸序列。利用DNAWorks的帮助，用两步PCR法，可以成功合成长度达到3000碱基对的基因。原始网站。
The Primer Generator 在线引物设计程序。
Primer 3 比较有名的在线引物设计程序。
Primo Pro 3.4 在线PCR引物设计java系列软件。
Web Primer 斯坦福大学提供的在线引物设计软件。
AutoPrime 快速设计真核表达实时定量PCR引物在线软件 .

一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。

附上两款软件使用方法！
Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
1. 功能
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计( )、限制性内切酶位点分析( )和DNA 基元(motif)查找( )。“Premier”还具有同源性分析功能（ ），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA 与蛋白序列的互换（ ）、语音提示键盘输入（ ）等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA 来设计引物，由于大多数氨基酸（20 种常见结构氨基酸中的18 种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA 的来源以相应的遗传密码规则转换DNA 和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。
2. 使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
(转载的时候就没有图)
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10 序列，-35 序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
进一步点击按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR 引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交****（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然
后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed 时，再按，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR 模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA 序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易 使用，是一个相当不错的软件。

Oligo 6.22 使用技巧简介
1. 功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo 5.0 的初始界面是两个图：Tm 图和ΔG 图；Oligo 6.22 的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq 图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2. 使用（以Oligo 6.22 为例）
Oligo 6.22 的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG 和Frq，其中Frq 是6.22 版本的新功能，为邻近6至7 个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade 排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo5.0，只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili 项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm 图块上左下角的Upper 按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。∆G 值反映了序列与模板的结合强度，最好引物的∆G 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm 值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq 曲线为“Oligo 6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5 为好。
当然，在设计克隆目的的PCR 引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR 需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR 的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行False priming site 的检测。这项检查
可以看出引物在非目的位点引发PCR 反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR 结果。一般在错配引发效率以不超过100 为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450 以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测，按Alt+P 键弹出PCR 窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物大小、Tm 值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5”的相类似，并且似乎并不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由Whitehead Institute开发的“Primer 3”等（本网站http://210.72.11.60/ 已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该软件的独特之处在于，对全基因组PCR 的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR 的用户试用。

8. 如何优化PCR反应中退火温度

首先要看你的条带是否清晰，虽然亮度不够但是清晰度应该高，没有拖尾没有非特异条带和引物二聚体，如果以上都没有，仅仅是目标条带不够亮的话，我觉得
你可以将25微升体积同比放大至50微升反应体系，相应的制胶的时候插孔槽用大梳子而不是小的那种。还有很重要的就是你的核酸染料是什么？我用过几种核酸染料感觉还是EB亮度最好，虽然毒性大了点。

如果条带不够亮，还有拖尾、非特异条带、引物二聚体等问题，那就是你反应体系中需要优化。1、出现非特异扩增可能是你的引物设计上特异性差或者引物浓度过高，Mg浓度或酶含量过高（适当改变Mg浓度从1mM到3mM，间隔0.5mM进行梯度试验，或者酶含量改变按0.5U为间隔梯度试验。）2、如果出现拖尾，，要考虑引物特异性和模板纯度，另外循环数、退火温度以及Mg含量过高、dNTP过多等也可能造成拖尾。

9. PCR条件优化

在PCR的优化开始阶段，应用新的DNA模板，引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的DNA产物的产率。表1列举了一些通常遇到的问题和对PCR反应进行优化的一些推荐方法。
表1 PCR扩增的疑难解析
问题 解释 补救措施
目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈不清晰的成片条带，条带在凝胶中扩散到较期望分子量更小的DNA分子量的区域内。 无效引导或无效延伸 通过建立两个引物不同浓度的PCR系列试验，从中发现两个引物的最适浓度；通过建立降落PCR系列试验，摸索最佳镁离子浓度的水平。
应用GC-Melt（Clonte-CH）PCR反应混合液。
应用尽可能低的复性温度（即退火温度）考虑添加佐剂，如在反应体系中加牛白蛋白（0.2~0.6mg/ml），二甲基亚砜（5%）或甘油（5%）
目的产物条带在阳性对照管2与试验管内呈现非常模糊的带型，而在阳性对照管1内却又很强的条带。 模板DNA不纯。 重新纯化模板DNA，用酚：氯仿抽提两次，乙醇沉淀回收。纯化后的DNA样品溶解于水中（不含EDTA）。
在阴性对照管扩增出目的条带。 盛模板DNA的塑料器具溶解模板DNA的溶液污染所致。 重新配置新的试剂。
扩增产物呈现明显的分子质量错误的条带。 根据一条或两条引物的非特异性引导。 缩短复性时间或增加复性温度。
扩增目的产物DNA呈现模糊的广泛的成片条带。 要么为引物二聚体所致的扩增；要么为模板DNA过量。 检查引物是否均一及模板DNA序列内是否具有高度重复序列存在。优化每条独立引物的浓度。
应用降落PCR和（或）热启动PCR。降低模板DNA的量。

对可能发生在PCR过程中的主要问题的解析
表2描写在PCR扩增反应中可能遇到的一些问题以及提供怎样解决这些问题的一些方法。
表2 多种PCR扩增过程的一些疑难问题的诊断与解决方法
症状 可能原因 补救措施
扩增的目的产物条带较弱或不能检测到相应的条带。 试剂不合格；PCR仪有故障；扩增程序设置错误。 在两台不同的PCR仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行PCR，比较其扩增产物结果。
复性条件不是最合适的。 重新计算引物Tm；应用降落PCR，最好再结合热启动PCR。
验证引物浓度，如果必要可优化引物的浓度；若引物显然是问题的症结所在，重新设计合成新的引物。
被复性结合到模板上的引物不适合延伸。 优化MgCl2、模板DNA和dNTP的浓度；试验此PCR的pH值的范围；考虑用N-三甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸或EPP等具有更低温度变异系数的化学物质替代Tris（Cheng et al. 1994）。
应用新鲜制备的热稳定DNA聚合酶。
重新纯化模板DNA以去除抑制物。
在恒定复性温度（55℃）条件下增加PCR循环数。
如果问题依然存在，添加增强剂（如10%二甲基亚砜，5% PEG6000或10%甘油）。
如果问题依然存在，用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增。
应用GC-Melt（CLONTECH）PCR反应混合液。
变性不完全。 增加变性的时间或者设置更高的变性温度。
两个引物之间的距离太大。 应用那些能够扩增大DNA片段的热稳定DNA聚合酶。
多种扩增产物条带 应用降落PCR，最好再结合热启动PCR或加强PCR（booster PCR）。
优化MgCl2、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。
用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增；或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行PCR扩增。
确证引物的浓度，如果必要，可优化引物的浓度；若问题仍然存在，重新设计合成引物。
引物二聚体过量 应用降落PCR，最好再结合热启动或加强PCR（booster PCR）；若问题仍然存在，重新设计合成引物，要特别注意引物3’末端的序列。

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